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M-MLV 逆转录酶

产品说明

M-MLV 逆转录酶是由一个  71 kD 的单亚基组成的重组型 DNA 逆转录聚合酶。可以催化以 RNA 或 DNA ： RNA 杂交链为模板的互补 DNA 的聚合反应。本酶经修饰 RNase H 活性比普通的逆转录酶要弱很多，因此在合成第一链 cDNA 的过程中，可保证 RNA 的降解程度较低，从而使得率提高。

产品组分

组分	R1041	R1042
M-MLV (200U/μl)	5000U/25 μl	10000U/50 μl
5× first-strand buffer	100 μl	200 μl

R1041 可进行 25 次逆转录反应， R1042 可进行 50 次逆转录反应（ 20 μl 标准  PCR 反应体系，每次使用  M-MLV 1 μl ）。

M-MLV 储存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ， 200 mM NaCl ， 0.1 mM EDTA ， 1 mM DTT ， 0.01% NP-40 ， 50% glycerol

5x first-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃) ， 375 mM KCl ， 15 mM MgCl₂ ， 50 mM DTT

保存条件

-20℃ 保存，避免反复冻融。

质量检测

逆转录酶活性检测

使用 [₃₂P]dCTP 作为标记， 200 U 的 M-MLV 以 1μg 、 1.2 kb 的 RNA 为模板进行逆转录反应，最低可得到 120 ng 的 cDNA ，所得 cDNA 长度  > 全长的 90% 。

核酸外切酶活性检测

混合 50 ng 的标记 DNA 或 RNA 与 200 U M-MLV 在 1× 反应缓冲液体系中， 37℃ 温浴 1 h ，检测 DNA 和 RNA 降解都不到总量的 1% 。

核酸内切酶活性检测

混合 1μg Ⅰ型超螺旋质粒 DNA 与 500 U M-MLV 在 1× 反应缓冲液体系中， 37 ℃温浴 1 h ，琼脂糖电泳检测，无明显的剪切。

适用范围

第一链 cDNA 合成； cDNA 文库构建； RT-PCR ；引物延伸； 3' 和  5' RACE 。

注意事项

l 成功的 cDNA 合成来自高质量的 RNA 。高质量的 RNA 至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂，如 EDTA 或  SDS 。用于 cDNA 合成反应的溶液试剂尽可能用 DEPC 进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。

l 为了增加贮存 RNA 样品的稳定性，可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存于 -70℃ 。用于保存  RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时，可以使用下列方法沉淀 RNA ：加入 NaCl 至 0.2 M 同时加入 4 倍体积的乙醇，室温放置 3-5 min ， 10,000 rpm 离心 5 min 。

l 在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂（ RNasin ）以增加 cDNA 合成的长度和产量。在第一链合成反应中， RNase 抑制剂在缓冲液和还原剂（如  DTT ）存在的条件下加入，因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放出 RNase 。但是 RNase 抑制剂仅防止 RNase A ， B ， C 对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的 RNase ，因此尽管使用了 RNase 抑制剂，也要小心不要从手指上引入 RNase 。

l 较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开，增加反应的产量。

l 使用简单的 RNA 纯化方法即可获得满足 RT-PCR 反应的 RNA ，但为了保证实验的成功率，建议使用 GTC 法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度 RNA 。

l 为防止 RNA 降解，应尽量避免反复冻融，最好保存于 -70℃ 。

l 最佳的 PCR 反应条件，因 PCR 扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下 control 反应，以确定最佳的 PCR 反应条件。

l cDNA 产物应置于 -20℃ 保存。

l 当以 cDNA 为模板进行 PCR 之前，使用 RNase H 处理 cDNA ，可以提高 PCR 反应的灵敏度。

操作步骤

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物

RNA	1-5 μg
Oligo (dT)15 或 Random primer	1 μl
RNase-free ddH2O	To 13.4 μl

2 进行变性退火反应

70℃ 温浴 5 min ，简短离心后冰浴 5 min 。

3 在上述离心管中配制反转录反应液

上述反应液	13.4 μl
5× first-strand buffer	4 μl
dNTPs （ 10 mM ）	1 μl
RNasin	0.6 μl
M-MLV	1 μl
Total	20 μl

4 按下列条件进行反转录反应

Oligo (dT)₁₅ ： 42℃ 温浴 60 min ；

Random primer ：  37℃ 温浴 60 min 。

5 终止反应

70℃ 温浴 5 min 终止反应，置冰上进行后续实验或 -20℃ 保存。

6 用 RNase-free ddH₂O 将反应体系稀释到 50μl ，取 2-5μl 进行 PCR 扩增反应。